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ELISA样本制备指南及注意事项

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定义及介绍

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）是最基础的免疫学实验之一，其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本，实验操作步骤并不繁琐，但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值，从而供下一步分析所用，因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。

样本制备指南

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血清

全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20min，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品

2.血浆

抗凝剂推荐使用EDTA-Na

，样品采集后30min内于2-8℃，1000×g离心15min，取上清即可检测。

3组织匀浆/组织全蛋白

用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10min，取上清检测。

其余方法：在分析天平（AL204型）上，称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液；并用小剪刀等工具将组织样本剪碎（尽可能小块）。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2s，间隔时间5s，总时间2min。放入样本，冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要，建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上，较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。

4.细胞提取液

贴壁细胞

用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5min后收集细胞；

可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10

个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10min，取上清检测。注：留取20μL样本，用于后续BCA测定。

其余方法：

对于

：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。

对于

：离心收集细胞，以2×10

细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成（5-10）×10

细胞/管，然后再裂解。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

5.细胞培养上清或其他生物体液

收集液体后于2-8℃，1000×g离心20min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注：因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响，不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。

实验细节与注意事项

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收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎，释放大量的过氧化物酶，会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶促反应，造成检测结果的不确定性。

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样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。

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试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩。

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检测样本的稀释推荐多步稀释法，常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍；细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍；建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。

对于稀释倍数比较大的检测样本，参考稀释方案如下：

稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；

稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；

稀释100000倍：三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；

每步稀释时取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。

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若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。

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若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

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某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

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对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本，经BCA法测定样本蛋白含量后，建议进行蛋白浓度的统一化，避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差；例如，统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL，进行后续的稀释和检测。

“文/贝贝豆（原创文章，欢迎个人转载分享）”

最近几年，尤其是开放二胎以后，男孩子就开始扎堆出生，无论是在大街上，还是幼儿园，放眼望去，基本都是

清一色的男孩子

难道是男孩子们商量好了，大家一起组团来了吗？

产房传来喜讯，又生儿子啦，新生儿男孩扎堆被护士“神预言”

同事小陈在医院待产，心里很紧张，家里老人重男轻女思想比较严重，所以小陈一直希望自己能生个男孩，让家里人开心，自己也能“母凭子贵”。

今天医院产房不断传来喜讯，护士们都在议论：

“刚才生的是男孩，又是一个男孩，今天第七个了。”

小陈听了，跟护士说起自己想要男孩的愿望，护士安慰小陈说：“一看你就是生男孩的命呢！而且我们今天医院中头彩了，早上生的都是男孩。你肯定是第八个生男孩的。”

过了一个小时，小陈也顺利分娩了，还果真是男孩，一家人开心不已，非常感谢护士的“神预言”。

男孩出生率高的原因，医生不说但要知道

一．自然法则，尊重自然结果

人类是大自然这个造物者缔造出来的高级产物。女娲在造人时随手捏的泥人，她也没数多少个男孩子，多少个女孩子，只是“做人”开心就好。所以男孩和女孩出生的几率是自然的法则。

我国男女出生的比例是106：100

找代母的后遗症

二．人类干预，增加男孩出生几率

人工受孕找代母

1) 传统封建思想，一定得生男孩

我们国家传统封建的“传宗接代”思想像孔子的孝道一样，传了一代又一代，早已根深蒂固，而老人更是奉之为一身的家族使命，所以都期望自己的孩子能生一个大孙子，家族香火可以永不灭。

甚至有一些老母亲自己生的都是女儿，还会一直跟女儿强调生男孩的重要性，她们曾经因为没有生男孩而被四邻八方嘲笑过，深知没有男儿伴身的自卑感。

所以有些孕妈怀了女孩放弃，坏了男孩分娩，这就造成了男孩出生几率更高。

2）

试管婴儿的普及，导致男孩增多

我国二胎政策开放以后，婴儿的出生率直线上升，很多高龄妈妈会选择试管婴儿生娃，可以对男女做出选择，这也就直接导致了男孩增多。

生男生女不能勉强，男孩太多，婚姻成问题

现在生活中，还在单身的人很多，婚姻已经成为了现代年轻人的重点关心问题。更何况这些年男孩出生几率的提高，大大加重了男女比例的失衡。

再过20年，等到这一代孩子到了适婚年纪，

父母就该担心的就是自己儿子的婚姻问题

“还不如当初生个女孩！”

如今女孩子的优越感很强，都希望自己能找到有钱有房有颜有身材的男人，多少父母为了让儿子条件好一些，能找到老婆，砸锅卖铁，

拼了老命地赚钱给儿子买房买车买名牌，凑个十几万的彩礼钱，最后却落了个被儿子嫌弃没钱的份。

孩子都是父母的心头肉，只要以后孩子生活美满，做父母的就已经满足了，儿女孝顺，又何来男女之分呢？弄璋之喜，弄瓦之喜，同样是喜。

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